三代測(cè)序
三代測(cè)序簡(jiǎn)介
【添加時(shí)間：2016-09-05 09:17:49】【來源：】【作者：dggadmin】
第三代測(cè)序技術(shù)是指單分子測(cè)序技術(shù)。測(cè)序不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序。主要代表為美國(guó)Pacific Bioscience公司的SMRT技術(shù)。脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡可以實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，其熒光就同時(shí)能在DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，其熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣。最新推出的Sequel單分子測(cè)序平臺(tái)保留了PacBio RS II長(zhǎng)讀取、均一覆蓋和甲基化信息的優(yōu)勢(shì)，其測(cè)序通量是后者的7倍。
第三代測(cè)序的技術(shù)特點(diǎn)是：
圖1：PacBio RS II 測(cè)序儀
圖2：PacBio Sequel測(cè)序儀
圖3： SMRT技術(shù)建庫(kù)流程
第三代測(cè)序的技術(shù)特點(diǎn)是：
1、實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬倍。
2、實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列（可以測(cè)幾千個(gè)堿基）。
3、精度非常高，達(dá)到99.9999%。
4、直接測(cè)RNA的序列。以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測(cè)序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。
5、第二個(gè)是直接測(cè)甲基化的DNA序列。DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同。根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。
第三代測(cè)序的應(yīng)用主要有三個(gè)方面：
1. 基因組測(cè)序
第三代測(cè)序的應(yīng)用主要有三個(gè)方面：
1. 基因組測(cè)序
由于具有讀長(zhǎng)長(zhǎng)的特點(diǎn)，SMRT測(cè)序平臺(tái)在基因組測(cè)序中能降低測(cè)序后的Contig數(shù)量，明顯減少后續(xù)的基因組拼接和注釋的工作量，節(jié)省大量的時(shí)間。
2. 甲基化研究
SMRT技術(shù)采用的是對(duì)DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法，聚合酶合成每一個(gè)堿基，都有一個(gè)時(shí)間段，而當(dāng)模板堿基帶有修飾時(shí)，聚合酶會(huì)慢下來，使帶有修飾的堿基兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1，由此就可以推斷這個(gè)位置有修飾。通過聚合酶動(dòng)力學(xué)提供的信息，可直接檢測(cè)到DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，為表觀遺傳學(xué)研究打開了一條通路。
3. 突變鑒定 (SNP檢測(cè))
單分子測(cè)序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且沒有PCR擴(kuò)增步驟，就沒有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤，該優(yōu)勢(shì)使其在特定序列的SNP檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定中大顯身手。
2. 甲基化研究
SMRT技術(shù)采用的是對(duì)DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法，聚合酶合成每一個(gè)堿基，都有一個(gè)時(shí)間段，而當(dāng)模板堿基帶有修飾時(shí)，聚合酶會(huì)慢下來，使帶有修飾的堿基兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列的距離之間的比值如果大于1，由此就可以推斷這個(gè)位置有修飾。通過聚合酶動(dòng)力學(xué)提供的信息，可直接檢測(cè)到DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，為表觀遺傳學(xué)研究打開了一條通路。
3. 突變鑒定 (SNP檢測(cè))
單分子測(cè)序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且沒有PCR擴(kuò)增步驟，就沒有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤，該優(yōu)勢(shì)使其在特定序列的SNP檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定中大顯身手。
圖4 用三代測(cè)序技術(shù)研究細(xì)菌基因組和甲基化組
