環(huán)境微生物測序分析
微生物群落多樣性--擴增子測序
【添加時(shí)間:2016-07-20 14:13:08】【來(lái)源:】【作者:weiliang】
    環(huán)境樣品的單基因擴增子測序,主要是利用HiSeq/MiSeq平臺對原核16S rRNA、真菌18S rRNA、真菌ITS、功能基因擴增子測序??蛻?hù)只需要提供高質(zhì)量的DNA樣品,由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行PCR擴增及上機測序,獲得環(huán)境樣品中單個(gè)基因的組成和多樣性信息。

    16S rRNA是目前最常用的生物標志物,廣泛應用于微生物的系統進(jìn)化、分類(lèi)及多樣性研究中。16S rRNA占細菌總RNA量的80%以上,基因序列長(cháng)短適中,其結構中既有保守區域,又有變異區域,是較好的生物標志物。人們根據16S rRNA基因不同區域序列的可變性將其分為9 個(gè)可變區和9 個(gè)保守區(圖1)

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    圖1 16S rRNA 基因保守區和可變區的分布

   擴增子測序實(shí)驗流程如下:
    1. 基因組DNA提取
    不同樣品性質(zhì)不一樣,提取DNA的方法會(huì )有差異。對于土壤DNA提取,推薦使用PowerSoil® DNA Isolation Kit,該試劑盒也可以提取糞便、腸道內容物等樣品。
    2.  PCR
    根據保守區設計帶barcode的引物,以DNA為模版進(jìn)行PCR擴增。
    3. PCR產(chǎn)物純化和定量
    PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化,然后定量產(chǎn)物濃度。按照每個(gè)樣品的測序量要求,進(jìn)行相應比例的混合。
    4. 文庫構建及上機測序
    根據產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)構建文庫,并上機測序。
 
   
     擴增子測序數據分析方法見(jiàn)“生物信息學(xué)服務(wù)”。
   
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